篇名:
以即時RT-PCR 快速檢測牛流行熱病毒A SYBR Green I-Based Real-Time RT-PCR Assay for Bovine Ephemeral Fever Virus
作者:
丁履紉;李敏旭;李淑慧
中文摘要:
針對牛流行熱G醣蛋白基因設計一組引子,應用SYBR Green I即時RT-PCR快速診斷本病。將牛流行熱病毒RNA 連續1 0 倍稀釋,分別以傳統RT-PCR、巢式PCR 與即時RT-PCR 來檢測,比較三者敏感性差異,結果分別為100pg/μL、100 fg/μL、1 pg/μL,以巢式PCR敏感性最高,即時RT-PCR次之,傳統RT-PCR敏感度性最差。模擬病毒血症的血液檢體,以本試驗可以檢測出病毒力價極限為104.0 TCID 50/mL。另外,72 個送檢之疑似病例檢體,分別以上述三種PCR方法及病毒分離法來檢測,結果即時RT-PCR檢出率與巢式PCR同為19.04%(14/72), 比傳統RT-PCR 12.8%(8/72)和分離法18.06%(13/72)檢出率為高。以上結果顯示SYBR green I即時PCR 方法的建立,可作為臨床實驗室檢驗牛流行熱的一個新工具。
英文摘要:
A quantitative one-step SYBR Green I-based reverse-transcriptase (RT)- PCR system was developed for the detection of bovine ephemeral fever virus in samples. The primer pair was designed based on conserved sequences in the G protein and evaluated for clinical diagnosis. A serial of ten-fold dilutions of the viral genome were used as templates for the reaction in which they served as standards to quantitate unknown viral samples. By using this system it was shown that as few as 300 copies of a viral genome could be detected. The diagnostic sensitivity of the real time RT-PCR and conventional RT- PCR, nested PCR and cell culture method in the detection of 72 clinical samples suspected to have BEFV infections were 19.04%, 12.8%(8/72), 19.04%(14/72) and 18.06%(13/72), respectively. The results indicated that the assay developed in this study was more sensitive than the conventional RT-PCR and isolation for the detection of BEFV. The novel assay is an excellent diagnostic tool for BEF infection.
備註:
年份:西元 2006 年
期別: 第 41 期
詳細內容:
牛流行熱(bovine ephemeral fever)又稱暫時熱,病原為桿狀病毒科(Rhabdoviridae)的牛流行熱病毒(BEFV),經由Culicocides 庫蠓、Anopheles蚊和Culicine 糠蚊等昆蟲媒介傳染,流行地區包括非洲、亞洲、中東及大洋洲等地[3, 4, 5, 16]。主要症狀包括有雙波或多波發熱、顫抖、食慾不佳、眼、鼻有分泌物、流涎、呼吸困難、瘤胃鼓脹、抑鬱、跛足、僵硬及產乳量突然降低等[8, 14, 15]。亞熱帶地區發生季節約為夏天至早秋,通常6 個月至2 歲齡牛隻最易受感染而發病[17]。牛流行熱病毒的基因體為負股的單股RNA,具有5 個結構性蛋白包括核蛋白(N)、聚合?相關蛋白(P)、基質蛋白(M)、大核醣核酸?(L)和表面醣蛋白(G)[20]。 G 醣蛋白分子量約81 kDa 為第一型的膜醣蛋白,含有型別特異性和中和性抗原決定位[6],能激發牛隻產生保護性免疫[9]。以中和性單株抗體(MAbs)和抗中和性的單株抗體突變株,兩者以交叉競爭性結合試驗,結果可證實G 醣蛋白上有四個完整的中和抗原決定位分別為G1、G2、G3 和G4 [5]。雖然目前似乎全世界僅存在一種牛流行熱血清型,但根據Cybinski 比對分析許多澳洲分離株和大陸分離株,其認為某些分離株在抗原性的部份還是有一些改變[7]。7 株台灣牛流行熱分離株的G 醣蛋白基因片段,進行多序列比對及親緣樹分析,結果顯示可分為兩群,1983 年至1989 年為一群;1996 年至2002 為另一基因群[21]。血清交叉中和試驗結果顯示,1996 至2001年的分離株與1983年疫苗株應該屬於不同亞型,但仍為同一血清型[11]。  臺灣曾於1967 年、1983 至1984 年、1989 至1990年、1996年、1999年、2001年、2002年和2004爆發過8 次疫情,皆造成相當大的經濟損失 [1, 2, 4, 21,13]。自1984年起使用疫苗免疫政策來防範疾病的發生,1999 年之後的疾病流行形態從週期性爆發大流行轉變成小規模多處或單處散發疫情,但是間歇期漸漸縮短為2至3 年一次[12]。目前本病的診斷方法主要以發熱前期或初期的抗凝血液以RT-PCR初步鑑定,並以細胞株盲目繼代分離、哺乳小鼠腦內接種分離等病原檢測方法,或是以配對血清抗體陽轉或各種的血清學試驗[2]。即時定量PCR(real-time quantitative PCR)是一種改良自傳統PCR 的新技術,它利用帶有螢光的探針(probe)或是可與DNA 結合的螢光染劑(例如SYBR green I)在PCR 的增幅過程中不斷地嵌入產物當中,並以電腦即時地偵測螢光訊號的強度來反映PCR 產物累積的程度,繼而分析螢光強度與PCR循環數的關係,再與已知量的標準DNA 相比較,將模板中所含的DNA 進行定性與定量分析[10,18,19]。本研究的目的便是藉由即時定量PCR的方法,以牛流行熱病毒當作模板RNA,藉此瞭解是否可以應用於臨床檢體,希望達到快速診斷病例的功效,並憑著此法的高敏感性對病毒的檢出率有所提昇。
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附件名稱:
以及時PT-PCR快速檢測牛流行熱病毒
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