篇名:
雞飼料中合成抗菌劑同時檢測方法之開發Development and Application of Simultaneous Determination of Synthetic Antimicrobial Drugs in Chicken Feeds
作者:
林金梅 ;劉敏主; 郭美月 ;林士鈺 ;楊喜金
中文摘要:
應用高效液相層析法同時檢測雞飼料中sulfamethazine ( SMT )、sulfamerazine ( SMR )、 sulfathiazole ( STZ )、sulfamonomethoxine ( SMM )、sulfadimethoxine ( SDM )、sulfaquinoxaline( SQX )、 oxolinic acid ( OXA )、piromidic acid ( PMA )及 nalidixic acid ( NAA )、flumequine ( FLU )等 10 種合成抗菌劑分為磺胺劑及非磺胺劑二部分分析。分析 OXA、 FLU 、NAA 回收率平均為 96.6%、 96.1%、 96.3%,分析 SMR、 SMT、 SDM、 SQX 回收率平均為 41.3%、 69.0%、 63.0%、 83.0%, 而 STZ 與 SMR 於添加飼料後滯留時間接近,不能同時檢測; SMM 會有干擾波峰。
英文摘要:
A high-performance liquid chromatography (HPLC) method for simultaneous determination of sulfamethazine (SMT), sulfamerazine (SMR), sulfathiazole (STZ), sulfamonomethoxine (SMM), sulfadimethoxine (SDM), sulfaquinoxaline (SQX), oxolinic acid (OXA), piromidic acid (PMA),and nalidixic acid (NAA) in chicken feeds was developed. The feed samples spiked with synthetic antimicrobial drugs at levels of 1.25, 5 and 20 ppm. respectively, were analysed. The average recovery rates of OXA , FLU and NAA were 96.6% , 96.1.0% and 96.3%, respectively. The average recovery rates of SMR , SMT , SDM , and SQX were 41.3% , 69.0% , 63.0% and 83%, respectively.
備註:
年份:西元 1999 年
期別:第 35 期
詳細內容:
飼料添加抗菌劑係為了增進動物之生長及維護健康,基於藥品維護動物及人體健康的重要性,國外對於畜水產品中合成抗菌劑之殘留鑽研較多,至於飼料中抗菌劑之分析大部分針對個別藥物為主。為簡化工作流程,提高工作效率,擬尋求簡易快速分析方法作為雞飼料中多種合成抗菌劑同時檢測之用。( 1,2,3,4,5,6 )。材料與方法1.標準曲線之建立(1)混合標準品原液:精取SMR 、SMT、 SDM、 SQX對照標準品 ( Sigma及關東化學產品 ) 各50 mg各置入50 ml 褐色定量瓶,另OXA、 NAA、 FLU、PMA對照標準品 ( Sigma及Alcor公司分贈 ) 各50 mg各置入50 ml 褐色定量瓶中,以氰甲烷 ( E. Merck 產品 ) 溶解並稀釋至定容,再以氰甲烷10 倍稀釋成濃度為100 μg/ml。(2)混合標準溶液:量取標準品溶液10 ml 再以氰甲烷稀釋1/4及1/16 使濃度為25 μg/ml 及6.25μg/ml。 2.檢體前處理:(1) OXA、NAA、FLU及PMA檢測樣品前處理:參考ROBERT K.等 ( 1995 )(5) 及Ishii Rie等1994(6)之方法加以改良:飼料樣品5 g置50 ml褐色離心瓶加24 ml丙酮振盪10分鐘,經離心3000 rpm ( Kubota 5100, rotor RS-720, Japan )2 分鐘,取上清液經濾紙過濾入梨形瓶,殘渣再以25 ml 丙酮二次萃取,合併萃取液入梨形瓶,40℃減壓濃縮至乾,加丙酮10 ml 洗梨形瓶,並加入10 ml 正己烷 ( E. Merck產品 ) ,30 ml 3%氯化鈉溶液,振搖10 秒,置離心瓶,3000 rpm 離心1 分鐘,棄正己烷層,用10 ml 正己烷再去油質一次,把剩餘之液體移至250 ml 分液漏斗中,用25 ml氯仿 ( E. Merck 產品 ) 潤濕遠心管後再加至分液漏斗中振盪1 分鐘,待分層後,取氯仿層(下層)至另一個分液漏斗中第二次再用25 ml氯仿萃取1次,合併氯仿層,加25 ml 0.1M 氫氧化鈉溶液,振盪1 分鐘,靜置使分層,丟棄氯仿層,再用25 ml 氯仿,小心前後輕搖10 次,避免起泡,丟棄氯仿層,後加入25 ml 0.075 M磷酸,再加入25 ml 氯仿,劇烈振盪1 分鐘,流出下層,通過12.5 cm 濾紙入梨形瓶,再用25 ml 氯仿再次萃取一次,合併氯仿層液,於40℃減壓至乾,加入2 ml 氰甲烷,再減壓至乾,殘渣以1 ml 移動相經超音波振盪溶解,經0.45 μm 濾膜 ( Nylon 材質 ) 過濾後注入HPLC 檢測。(2)磺胺劑樣品檢測前處理:取雞飼料樣品5 g,以25 ml 氰甲烷萃取,經離心 ( 3000 rpm, 10 分鐘 ) ,殘渣再以25 ml氰甲烷重複一次上述步驟,合併二次氰甲烷液各入褐色色析管經(1)酸性三氧化二鋁5 g,先以10 ml 氰甲烷活化(2)經鹼性三氧化二鋁(3)經Sep pak C18 cartrige (4)經Sep pak silica處理後,經減壓濃縮蒸乾。殘渣以氰甲烷:0.1%磷酸 ( 4:6 ) 1 ml 經超音波振盪溶解,經0.45 μm 之濾膜過濾後注入HPLC 檢測,以求取較好的前處理檢測方法。3. OXA、NAA、FLU分析條件:(1)高效液相層析分離管柱:Mightysil RP-18GP 150×4.6 mm( 5μm ) 高純度silica gel。(2)移動相:0.02 M Phosphoric acid – acetonitrile – tetrahydrofuran ( 72+16+12 )(3)螢光檢測波長:激發波長325 nm,吸收波長365 nm。(4)流速:1 ml/min(5)注入量:10 μl(6)高效液相層析儀: Hitachi 幫浦:L-6200 型;檢測器:L-4250 型:記錄器: D-2500型及canonBjc-210sp:column oven:L-7300型,檢測器Hitachi L-4250,螢光HitachiF-1050。4. SMR、SMT、SDM、SQX分析條件:(1)高效液相層析分離管柱:Mightysil RP-18GP 150×4.6 mm( 5μm ) 高純度silica gel。(2)移動相:25 mM NaH2PO4-CH3CN ( 80:20 )(3)UV檢測波長:254 nm(4)流速:1 ml/min(5)注入量:20 μl5.回收率試驗:取雞飼料5 g 3 份,置50 ml 褐色離心瓶,各別加入OXA、NAA、FLU混合標準溶液 ( 100 μg/ml ) 1 ml, ( 25 μg/ml ) 1 ml, ( 6.25μg/ml ) 1 ml 使其為20、5、1.25 μg/g。依上述前處理方法及分析條件測試。雞飼料5 g 3 份,置50 ml 褐色離心瓶,各別加入SMR、SMT、SDM、SQX混合標準溶液 ( 100μg/ml ) 1 ml, ( 25 μg/ml ) 1 ml, ( 6.25 μg/ml ) 1 ml 使其為20、5、1.25 μg/g。依前處理方法經酸性三氧化二鋁淨化再依檢測波長254 nm,移動相25 mM NaH2PO4:CH3CN ( 80:20 ) 測試。結  果添加NAA、OXA、FLU之檢體回收率皆有96% 以上 (表1 ) ,且線性良好, [ 如圖2,R 值接近於1 ] 。又檢體中同時檢測磺胺劑部分,以經酸性三氧化二鋁處理後的氰甲烷液經減壓濃縮蒸乾,殘渣再以25 mM NaH2PO4:CH3CN ( 80:20 ) 1 ml 溶解注入HPLC,較無干擾波峰出現,但只出現SMT、SMR、SDM、SQX四支波峰。討  論NAA、OXA、FLU、PMA,以前處理方法經濃縮蒸乾再以0.02 M 磷酸:氰甲烷:四氫夫喃 ( 72:16:12 ) 1 ml 溶解,經HPLC 分析,於UV 280 nm 檢測,雖可同時檢出,但回收率為70.6%、99.4%、77.6%、30.2%,且雜波峰較多,如圖1,若改以螢光檢測,激發波長325 nm,吸收波長365 nm,則OXA、NAA、FLU 回收率皆有96% 以上,如圖2。另六種磺胺劑若以管柱溫度40℃,25 mMNaH2PO4:CH3CN為移動相作梯度分析,標準品可得到良好結果如圖3,但添加飼料後只剩SMT、SMR、SQX 三支波峰,且回收率也不理想 ( 約只剩1/3 左右 ) 又檢體以經酸性三氧化二鋁處理後的氰甲烷液經減壓濃縮蒸乾,殘渣再以移動相1 ml 溶解注入HPLC,較無干擾波峰出現,但SMR與STZ滯留時間接近,SMM 波峰變成很小支‧也曾試以5×10-3 M 醋酸:甲醇 ( 60:40 ) 為移動相,波長230 nm,樣品經前處理方法,結果SMR、SMT、SDM、SQX 滯留時間雖於10 分鐘內,但回收率只26.6%、56.9%、60.1%、46.3% ,如圖5。經試多種檢測波長( 230 nm,254 nm,265 nm )及多種移動相,如80% 氰甲烷:0.1% 磷酸 ( 25:75 ) 或25 mM NaH2PO4:CH3CN ( 80:20 ) 或以25 mM NaH2PO4:CH3CN作梯度分析,及以不同條件淨化處理,結果發現添加藥品在飼料中所呈現波峰不是雜訊多,就是空白飼料有很多波峰或是波峰沒有呈現,也有波峰滯留時間接近易干擾如STZ與SMR,而SMM 則只呈現小波峰,回收率甚低。
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雞飼料中合成抗菌劑同時檢測方法之開發
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